Kit ELISA de 15-LO (araquidonato 15-lipoxigenasa) de rata

I. Información del producto:

Este kit ELISA utiliza un formato de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) tipo sándwich. La microplaca proporcionada está prerrecubierta con un anticuerpo de captura dirigido contra 15-LO de rata. Se introducen estándares o muestras de prueba en los pocillos, lo que permite que el antígeno se una al anticuerpo inmovilizado. Posteriormente, se añade un anticuerpo de detección marcado con biotina específico para 15-LO de rata, seguido de un conjugado de avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP). Tras la incubación y el lavado para eliminar los materiales no unidos, se dispensa solución de sustrato en cada pocillo. Solo se desarrolla un color azul en los pocillos donde están presentes 15-LO de rata, el anticuerpo de detección biotinilado y el conjugado de avidina-HRP. La reacción enzimática se detiene con solución de parada, cambiando el color a amarillo. A continuación, se mide la absorbancia a 450 nm ± 2 nm, siendo los valores de densidad óptica (DO) directamente proporcionales a la concentración de 15-LO de rata. Finalmente, las concentraciones de muestra se determinan trazando sus lecturas de DO contra una curva estándar.

II.Protocolo de prueba de muestra:

1. Se recomienda utilizar muestras frescas sin un almacenamiento prolongado. De lo contrario, podrían degradarse y desnaturalizarse las proteínas, lo que podría generar resultados erróneos.

2. Solo nos responsabilizamos del kit en sí, pero no de las muestras consumidas durante el ensayo. Los usuarios deben calcular la cantidad de muestras que se utilizarán en toda la prueba. Reserve suficientes muestras con antelación.

3. El rango de detección del kit no es equivalente al rango de concentración del analito en la muestra. Se recomienda consultar referencias, realizar experimentos preliminares o buscar soporte técnico para estimar la concentración del analito en la muestra. Si la concentración del analito en la muestra es demasiado alta o demasiado baja, se debe realizar una dilución o concentración adecuada de la muestra.

4. Si el tipo de muestra no está incluido en el manual, se sugiere un experimento preliminar para verificar la validez.

III. Preparación de reactivos:

1. Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 ℃) antes. Si el kit no se utilizará en un ensayo, solo saque las tiras y reactivos necesarios para el experimento actual y guarde las tiras y reactivos restantes en las condiciones requeridas.

2. Tampón de lavado: diluya 30 ml de tampón de lavado concentrado con 720 ml de agua desionizada o destilada para preparar 750 ml de tampón de lavado. Nota: si se han formado cristales en el concentrado, caliéntelo en un baño de agua a 40 ℃ y mézclelo suavemente hasta que los cristales se hayan disuelto por completo.

3. Solución de trabajo estándar:

① Centrifugar: Centrifugar el estándar a 10 000×g durante 1 minuto.

② Añada 1 ml de estándar de referencia y diluyente de muestra, deje reposar 10 minutos y agite suavemente varias veces. Una vez disuelto por completo, mézclelo bien con una pipeta. Esta reconstitución produce una solución de trabajo de 1000 pg/ml.
③ Dilución seriada: Tome 7 tubos EP y añada 250 μL de solución de referencia y tampón de dilución de muestra a cada uno (el volumen se puede ajustar según el uso real, p. ej., 500 μL/tubo). Transfiera 250 μL de la solución de referencia de 1000 pg/mL al primer tubo y mezcle bien para obtener la solución de referencia de 1000 pg/mL. Continúe la dilución paso a paso hasta el penúltimo tubo. Este último servirá como blanco y no se debe transferir solución del penúltimo. La solución de referencia debe prepararse y usarse inmediatamente.

4. Solución de trabajo de Ab de Detección Biotinilado: Calcule la cantidad necesaria antes del experimento (100 μL/pocillo). Para la preparación, se debe preparar una cantidad ligeramente superior a la calculada. Centrifugue el Ab de Detección Biotinilado Concentrado a 800 × g durante 1 min y, a continuación, diluya el Ab de Detección Biotinilado Concentrado 100 × hasta obtener una solución de trabajo 1 × con diluyente de Ab de Detección Biotinilado (Ab de Detección Biotinilado Concentrado: Diluyente de Ab de Detección Biotinilado = 1:99).

5. Solución de trabajo de conjugado de HRP: Calcule la cantidad necesaria antes del experimento (100 μL/pocillo). Para la preparación, se debe preparar una cantidad ligeramente superior a la calculada. Centrifugue el conjugado de HRP concentrado a 800 × g durante 1 min y luego diluya el conjugado de HRP concentrado 100 × a una solución de trabajo 1 × con diluyente de conjugado de HRP (Conjugado de HRP concentrado: Diluyente de conjugado de HRP = 1:99).

6. Consejos para la operación experimental

① Las soluciones deben agregarse al fondo del pocillo de la microplaca ELISA, evitando tocar la pared interior y provocar la formación de espuma tanto como sea posible.

② Utilice las tiras analizadas inmediatamente después del paso de lavado. No permita que los pocillos se sequen.

③ Después de agregar el reactivo de sustrato, el tiempo de reacción se puede acortar o extender según el cambio de color real, pero no más de 30 minutos.

④ La adición de la solución de detención debe realizarse en el mismo orden que la solución de sustrato.

IV. Procedimiento de ensayo:

V. Aviso:
Solo para investigación en ciencias de la vida