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La electroforesis en gel de agarosa es un método convencional para separar e identificar ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular. Los ácidos nucleicos son electrolitos anfóteros con un punto isoeléctrico de pH 2-2,5. En los tampones de electroforesis convencionales (pH de aproximadamente 8,5), las moléculas de ácido nucleico están cargadas negativamente. La carga se mueve hacia el polo positivo en el campo eléctrico. Mediante la tecnología de electroforesis, se pueden separar moléculas de ARN de diferentes tamaños y conformaciones y, al observar el número, el tamaño y la forma de las bandas, se puede juzgar la integridad de las moléculas de ARN. En este proceso, la función principal del tampón de electroforesis es mantener el pH y hacer que la solución tenga una determinada conductividad. TAE (tampón de ácido tris-acético) y TBE (tampón de electroforesis de ácido tris-bórico) son tampones de uso común. ¿Cuál es la diferencia entre ellos? TAE (tampón Tris-acetato) Ventaja: ① Para fragmentos de ADN de más de 13 kb, el tampón TAE puede lograr mejores resultados de separación. ② En el tampón TAE, el estado superenrollado del ADN puede mantener mejor su verdadera masa molecular relativa durante la electroforesis. ③Adecuado para recuperar fragmentos de ADN y posteriores reacciones de digestión enzimática, etc. defecto:   La capacidad tampón es pequeña y el tampón TAE puede perder gradualmente su capacidad tampón de pH durante la electroforesis a largo plazo, lo que provoca cambios en el valor del pH. TBE (tampón de electroforesis de ácido bórico-TRIS) Ventaja: ① La capacidad de amortiguación es relativamente mayor, el valor del pH se puede mantener constante incluso durante la electroforesis a largo plazo y no es fácil provocar un sobrecalentamiento en el tanque de electroforesis. ② Adecuado para la separación electroforética de fragmentos más pequeños, como fragmentos de menos de 1 kb. Su alta resolución facilita la distinción de moléculas de diferentes tamaños, aumentando así la precisión de los experimentos. defecto: El componente de ácido bórico contenido puede afectar la eficiencia de recuperación de ARN y ADN y los experimentos de reacción enzimática posteriores.    

¡Hola amigos! Hoy los llevaré a un campo genial: ¡el cultivo celular! El cultivo celular es en realidad una tecnología que controla artificialmente el entorno de crecimiento celular en el laboratorio. En pocas palabras, se trata de crear un entorno de vida ideal para las células, permitiéndoles crecer, dividirse y propagarse libremente. ¡Imagínese que esto es como construir un pequeño "hogar" para las células, permitiéndoles expresar aquí sus habilidades y potencial! ¡Las aplicaciones de cultivo celular están literalmente en todas partes! En biomedicina, el cultivo celular nos ayuda a estudiar los misterios de las enfermedades, detectar nuevos fármacos y evaluar su eficacia. ¿Sabías? ¡Estos pequeños "ayudantes" del cultivo celular han aportado a la humanidad muchos medicamentos contra el cáncer, vacunas y otros avances médicos! No sólo eso, en el campo de la biotecnología el cultivo celular también es indispensable. Los científicos pueden utilizar la tecnología de cultivo celular para producir proteínas, hormonas y enzimas importantes, e incluso realizar ingeniería genética y biosíntesis. Estas tecnologías no sólo tienen un gran potencial en el campo médico, sino que también desempeñan un papel importante en la investigación y el desarrollo de muchas áreas de gran preocupación social, como los biocombustibles y las energías renovables. ?? Por supuesto, el cultivo celular es una tecnología compleja y sofisticada que requiere operaciones especializadas y una gran experiencia. Los científicos no sólo deben seleccionar líneas celulares adecuadas, sino también proporcionar medios de cultivo y condiciones de crecimiento apropiados, y monitorear y controlar el estado de crecimiento de las células. A continuación se detallan algunos pasos básicos y puntos clave para el cultivo celular: Seleccionar células: Primero, debe seleccionar el tipo de célula que desea cultivar. Dependiendo del propósito y las necesidades de la investigación, se pueden seleccionar diferentes tipos de células, como células tumorales, células primarias o líneas celulares transfectadas con genes específicos. Prepare el medio de cultivo: haga que el medio de cultivo sea apropiado para el tipo de célula elegido. El medio de cultivo es una solución líquida que contiene nutrientes, factores de crecimiento y suplementos que proporcionan los nutrientes y las condiciones ambientales necesarias para el cultivo celular. Disociación y paso de células: disociar las células cultivadas de los recipientes de cultivo (como placas de Petri o matraces) y redispersarlas en nuevos recipientes de cultivo. Este proceso, llamado paso celular, mantiene a las células creciendo y multiplicándose. Condiciones de cultivo de control: Condiciones de cultivo de control, incluida la temperatura, la humedad, la concentración de CO2 y el valor de pH del medio de cultivo. Estas condiciones ayudan a proporcionar un entorno celular adecuado y promover el crecimiento celular saludable. Control de la contaminación: Se deben mantener condiciones estériles durante el cultivo celular para evitar la contaminación por bacterias, hongos y otras células. La adopción de procedimientos estrictos de manipulación y esterilización es clave para garantizar la pureza del cultivo. Observación y operaciones experimentales: observe periódicamente la morfología, el crecimiento y la densidad celular de las células cultivadas. Según las necesidades experimentales específicas, se realizan procesamiento celular, tratamiento farmacológico, transfección genética y otras operaciones. El cultivo celular no es sólo una tecnología, sino también un arte. Cada cultivo exitoso es una reverencia por la vida y la búsqueda de la ciencia. ¡Espero que este artículo te brinde una comprensión más profunda del cultivo celular! ??  

1. Extracción de proteína tisular total: 2.1 Lave el tejido 1-2 veces con PBS preenfriado, córtelo en trozos pequeños y colóquelo en un tubo de molienda, agregue 3 piezas de perlas de molienda de 3 mm y agregue 10 veces el volumen de tejido de la solución de lisis (por ejemplo: 100 mg de tejido, agregue 1000 ul de solución de lisis líquida), configure el programa de trituración para triturar tejido; 2.2 Retire el tubo de molienda después de moler y colóquelo en hielo o en una solución de lisis de cuarto grado durante 30 minutos; 2.3 Centrifugar a 12000 rpm, 4°C durante 10 minutos, recoger el sobrenadante, que es la solución de proteína total. 2. Determinación de la concentración de proteínas (opcional): determine la concentración de proteínas según sea necesario, tome la solución de proteínas sin desnaturalizar y utilice el kit de determinación de la concentración de proteínas BCA para medir la concentración de proteínas. Para conocer métodos específicos, consulte las instrucciones del kit; 3. Desnaturalización de proteínas:Agregue tampón de carga de proteína reducida 5* a la solución de proteína en una proporción de 4:1, desnaturalícelo en un baño de metal a 95°C durante 10 minutos y guárdelo en un refrigerador de -20°C o -80° para su uso posterior. ; 4. Electroforesis 4.1 Limpiar la placa de vidrio; 4.2 Preparación del gel y carga de muestras; 4.2.1 ①. Primero, mueva las placas de sujeción de ambos lados hacia abajo, abra completamente los prensaestopas de ambos lados, inserte el vidrio cóncavo y el vidrio plano desde arriba en diagonal y colóquelos hacia abajo. La parte superior del cristal queda pegada en las ranuras de ambos lados; ②. Levante los casquillos de ambos lados, pellizque la parte izquierda del casquillo con las manos al mismo tiempo, tire de la placa de sujeción izquierda hacia arriba y asegúrela en la parte superior; luego pellizque el lado derecho del casquillo al mismo tiempo, tire de la placa de sujeción derecha hacia arriba y fíjela. a lo más alto; ③. Después de confirmar que el vidrio de electroforesis está sujeto y alineado, desenrosque las perillas en ambos lados de la base de fabricación de gel, luego coloque el soporte de electroforesis en el medio de la base de fabricación de gel y sujételo, luego presione el soporte del cuerpo principal con las manos y Apriete las perillas en ambos lados hasta que gire hasta el límite. 4.2.2 Seleccione kits de fabricación de gel de diferentes concentraciones según los requisitos experimentales, mezcle las soluciones A y B en proporciones iguales y prepare la solución de gel inferior y la solución de gel superior respectivamente. Para placas de vidrio de diferentes especificaciones y espesores, los volúmenes de las soluciones de pegamento superior e inferior se pueden ajustar en proporciones iguales. Tomando como ejemplo la placa de gel de 8,3 cm × 7,3 cm (una sola pieza) comúnmente utilizada, el sistema de preparación recomendado es el siguiente:; Grupo de formulación Formulación Placa de vidrio de 0,75 mm Placa de vidrio de 1,0 mm Placa de vidrio de 1,5 mm Solución de pegamento inferior 10% Solución de pegamento inferior A 2 ml 2,5 ml 4ml 10% Solución de pegamento inferior B 2 ml 2,5 ml 4ml AP 24 µL 30 µL 48 µL Solución de pegamento superior Solución de pegamento superior A 1 mililitro 1 mililitro 1,5 ml Solución de pegamento superior B (color rojo) 1 mililitro 1 mililitro 1,5 ml AP 12 µl 12 µl 18 µL 4.2.3 Después de ensamblar el fabricante de pegamento, primero agregue la solución de pegamento inferior preparada y luego use agua pura o etanol para sellar la superficie del pegamento inferior. Después de que el pegamento inferior se haya solidificado por completo (aproximadamente 10 a 15 minutos), deseche el agua o el etanol y use papel de filtro para absorber el líquido restante, luego agregue la solución de pegamento superior preparada, inserte el peine y espere a que se solidifique ( unos 10-15 minutos) antes de su uso; 4.2.4 Retire el cuerpo principal del generador de gel, saque con cuidado el peine y prepárese para iniciar la electroforesis; 5. Después de colocar el cuerpo principal del generador de gel en el tanque de electroforesis, llene el interior con tampón de electroforesis y agregue 1/3 con el exterior. Utilice un voltaje constante de 200 V durante 30 minutos hasta que el azul de bromofenol esté aproximadamente a 1 cm del fondo. La electroforesis finaliza y la electroforesis está lista para la transferencia. 6. Transferir película 6.1 Prepare 6 piezas de papel de filtro de transferencia de 7 × 9 cm (fino) y una membrana de PVDF de 5 × 8 cm. La membrana de PVDF debe activarse con etanol durante 2 minutos antes de su uso; 6.2 Coloque el clip de transferencia, dos esponjas, papel de filtro y membrana de PVDF activada en el recipiente con la solución de transferencia; 6.3 Extienda la carpeta de transferencia, con rojo a la izquierda y negro a la derecha. Agrega una esponja y tres trozos de papel de filtro a cada lado; 6.4 Retire con cuidado el pegamento de separación y colóquelo sobre el papel de filtro (el pegamento se coloca en el costado del clip de transferencia negro). Utilice el líquido de transferencia para enjuagar las burbujas del pegamento. Pegue lentamente la película de PVDF al pegamento. Tenga cuidado de que no queden burbujas. Luego pegue la película de transferencia por turno. Papel de filtro de membrana, esponja de transferencia; 6.5 Condiciones de transferencia (transferencia húmeda): Corriente constante, 300 mA durante media hora. 7. Respuesta inmune 7.1 Coloque la membrana transferida en una caja de incubación que contenga TBST, enjuáguela rápidamente, luego agregue 5 ml de leche desnatada al 5%, colóquela en una coctelera decolorante y bloquee a temperatura ambiente durante 30 minutos; 7.2 Según las instrucciones del anticuerpo, diluya el anticuerpo primario. Después de la configuración, vierta la solución de bloqueo en la caja de incubación, agregue el anticuerpo primario preparado e incube a 4 °C en un agitador durante la noche (agite el agitador lentamente); 7.3 Recupere el anticuerpo primario, enjuague la membrana rápidamente con TBST tres veces, luego agregue TBST, colóquelo en un agitador de tinción para una elución rápida, lave tres veces durante 5 minutos cada vez; 7.4 Diluir el anticuerpo secundario con TBST en una proporción de 1:5000, luego agregarlo a la caja de incubación, colocarlo en un agitador y agitar lentamente e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos; 7.5 Enjuague la membrana rápidamente con TBST tres veces, luego agregue TBST, colóquela en un agitador decolorante para una elución rápida, lave tres veces durante 5 minutos cada vez. 8. quimioluminiscenciaMezcle las soluciones ECL A y B en una proporción de 1:1 y reserve. Saque la membrana de PVDF eluida y colóquela sobre papel absorbente. Absorba ligeramente el líquido de la membrana y coloque la membrana en la ECL mezclada. En el líquido luminiscente, deje que el líquido sumerja completamente la membrana. Después de la reacción durante 1 minuto, saque la membrana y colóquela en la bandeja del instrumento de quimioluminiscencia. Inicie la quimioluminiscencia según el programa preestablecido. Una vez completada la exposición, guarde la imagen original en formato TIFF. 9. Resultados y análisis del BM

Los colegas que venden pipetas suelen recibir preguntas de clientes recomendados: "¿Puede darme un juego de pipetas? Se pueden utilizar en todos los rangos de medición, como un juego de cuatro". A petición de los clientes, generalmente se recomiendan pipetas con cuatro rangos de medición de 0,5 a 10 uL, 5 a 50 uL, 10 a 100 uL y 100 a 1000 uL. A primera vista, parece que lo que el cliente compra cubre casi toda la gama de micropipetas, y parece que todo se hace a la perfección, ¡pero no es así! Después de muchos años de trabajo posventa de pipetas, hemos recopilado comentarios de los clientes sobre problemas como el pipeteo incorrecto y la dificultad de uso, que a menudo surgen de la selección inicial del juego.Tomemos el ejemplo más común: los clientes suelen dar la mayor cantidad de comentarios sobre el pipeteo cuando usan una pipeta de 10 uL para transferir líquidos dentro de 1 uL. En teoría, una pipeta con un rango de medición de 0,5 a 10 uL no tiene problemas cuando se utilizan líquidos entre 0,5 y 1 uL. ¿Por qué los clientes suelen informar la mayoría de los problemas en este rango de medición? Por debajo de 1uL es una operación de líquido ultramicro. La cantidad de líquido es casi invisible a simple vista. Las habilidades básicas de operación de líquidos son muy altas, como: enjuague, profundidad de inserción y otros detalles técnicos. Por ejemplo: detalles técnicos como enjuague, profundidad de nivel de líquido de inserción, etc. Además, la calidad del cabezal de succión también tiene un gran impacto en esta operación de microvolumen. Algunas puntas de succión de mala calidad tendrán rebabas de plástico residuales en el extremo del cabezal de succión. Estas puntas de mala calidad tienen efectos casi fatales en la micropipeta. Cuando se utilizan puntas de calidad normal, la mayoría de los operadores optan por utilizar pipetas con un rango de 0,1-2 uL. Para operaciones de transferencia de líquidos por debajo de 1 uL, el efecto de pipeteo es significativamente mejor que el de las pipetas con un rango de 0,5 a 10 uL.A continuación tomamos la pipeta Yanbio como ejemplo para ilustrar:El rango general de pipetas ajustables de precisión ordinarias está entre 0,1 uL y 10 ml. Los diferentes rangos se muestran en la siguiente tabla:Nombre del artículoCat.No.Volumen nominalRango de volumenIncrementoPipeta monocanalYB-P2.52,5 µL0,1-2,5 µL0,05 µLYB-P1010 µl1-10 µl0,1 µLYB-P2020 µL2-20 µl0,1 µLYB-P100100 µl10-100 µL1 µlYB-P200200 µL20-200 µl1 µlYB-P10001000 µL100-1000 µL5 µlYB-P50005000 µL1000-5000 µL50 µlYB-P1000010 mililitros1-10 ml100 µlPipeta de 8 canalesYB-PM1010 µl1-10 µl0,1 µLYB-PM100100 µl10-100 µL1 µlYB-PM300300 µL50-300 µL1 µlYB-PM10001000 µL100-1000 µL5 µl Los diferentes modelos de pipetas tienen diferentes rangos. Cuando elegimos una pipeta, muchas veces nos aparecerá un rango determinado, pudiendo bastar con varias pipetas de diferentes modelos. Cómo elegir la pipeta con el volumen más adecuado.Ejemplo: se requiere una pipeta y el volumen que se suele pipetear es de 20 uL. Tenemos cuatro tipos diferentes de dispensadores de líquido disponibles de 2-20 uL (modelo YB-P20) / 5-50 uL (modelo YB-P50) / 10-100 uL (modelo YB-P100) / 20-200 uL (modelo YB-P200). ¿Qué pipeta tiene el error más pequeño a 20 uL?De acuerdo con nuestra rutina diaria de selección de productos, creemos que sería más apropiado si el volumen objetivo está en el rango medio, y elegiremos empíricamente 5-50uL (modelo YB-P50). ¿Es este el caso? Echemos un vistazo a los resultados de los datos:Utilicemos estos cuatro tipos de pipetas para hacer un análisis de errores:Gato. No.:VolumenError a 20 ulYB-P2020-20 ul±0.2uLYB-P505-50 ul±0.5uLYB-P10010-100 ul±0.6uLYB-P20020-200 ul±1.0uLSe puede ver que la pipeta de 2-20 uL es la más adecuada en términos de exactitud y precisión, y el volumen objetivo de 20 uL es el más adecuado.