Kit de extracción de ADN en gel de agarosa, columna de centrifugación, biología molecular, investigación en ciencias de la vida

Introducción del producto

En presencia de una sal caotrópica de alta concentración, los fragmentos de ADN se unen selectivamente a la membrana de sílice en la columna de centrifugación. Mediante una serie de lavados y centrifugaciones rápidas, el tampón de lavado elimina impurezas como cebadores, nucleótidos, proteínas y enzimas. Finalmente, se utiliza un tampón de elución con bajo contenido de sal y pH alto para eluir el ADN purificado de la membrana de sílice.

I. Información del producto:

II. Condiciones de almacenamiento:

1.Este kit se puede almacenar durante 12 meses en condiciones secas a temperatura ambiente (15 °C–25 °C).

2.Todas las soluciones deben ser transparentes. Si se produce precipitación debido a la baja temperatura, no deben utilizarse directamente. Calentarlas en un baño de agua a 37 °C durante varios minutos restaurará su transparencia. Antes de usarlas, deje que las soluciones recuperen la temperatura ambiente.

3.El almacenamiento a bajas temperaturas (4 °C o –20 °C) puede provocar precipitaciones y afectar el rendimiento; por lo tanto, el transporte y el almacenamiento deben realizarse a temperatura ambiente (15 °C–25 °C).

4.Para evitar la evaporación, oxidación o cambios de pH debido a la exposición prolongada al aire, cierre bien todos los recipientes de solución inmediatamente después de su uso.

III. Materiales que debe preparar el usuario:

Etanol absoluto, centrífuga de alta velocidad de sobremesa, baño de agua a temperatura constante, pipetas, tanque de electroforesis, sistema de imágenes en gel, etc.; marcador de ADN, colorante de carga, agarosa, tampón de electroforesis (1× TAE o 0,5× TBE), tubos de centrífuga de 1,5 mL, etc.

IV. Descripción del producto:

En presencia de una sal caotrópica de alta concentración, los fragmentos de ADN se unen selectivamente a la membrana de sílice en la columna de centrifugación. Mediante una serie de lavados y centrifugaciones rápidas, el tampón de lavado elimina impurezas como cebadores, nucleótidos, proteínas y enzimas. Finalmente, se utiliza un tampón de elución con bajo contenido de sal y pH alto para eluir el ADN purificado de la membrana de sílice.

V. Características del producto:

1.Todas las membranas de sílice en las columnas de centrifugación están hechas de material de adsorción de alta calidad y especialmente diseñado, lo que garantiza una variación mínima en la capacidad de unión entre columnas.

2.El tampón de lisis de alta calidad no contiene yoduro de sodio ni perclorato, que se encuentran comúnmente en las formulaciones tradicionales, lo que evita la inhibición de reacciones enzimáticas posteriores, como la digestión, la ligadura y la clonación, después de la recuperación.

3. El tampón de lisis Buffer DD está teñido con rojo fenol, lo que proporciona un color amarillo que facilita el monitoreo visual del progreso de la lisis y los cambios de pH, optimizando así las condiciones de unión y mejorando significativamente la eficiencia de recuperación.

4. La formulación mejorada del tampón de lisis Buffer DD mejora enormemente la capacidad de amortiguación y la estabilidad, manteniendo el pH dentro del rango de unión óptimo incluso con tipos de muestras muy variables.

5.El procedimiento es rápido y cómodo, eliminando la necesidad de reactivos tóxicos como fenol y cloroformo, así como la precipitación con etanol.

VI. Solicitud:

Este producto es adecuado para la recuperación de fragmentos de ADN de entre 100 pb y 5 kb en geles de agarosa que contienen entre 1 y 15 μg de fragmentos de ADN. La tasa de recuperación puede alcanzar hasta el 85 %. Los fragmentos de ADN recuperados son adecuados para diversos experimentos rutinarios, como la digestión enzimática, la ligación, la transformación, la preparación de plantillas de PCR, la secuenciación y la construcción de bibliotecas.

VII. Precauciones:

1.Este producto está destinado exclusivamente a fines de investigación. No está autorizado para su aplicación en medicina, diagnóstico clínico, alimentos, cosméticos ni fines afines.

2.El tampón de lisis contiene compuestos irritantes. Se recomienda el uso de guantes de látex durante la operación para evitar el contacto con la piel, los ojos o la ropa. En caso de contacto con la piel o los ojos, enjuagar inmediatamente con abundante agua o suero fisiológico.

3. El rango típico de recuperación de fragmentos de ADN purificados se encuentra entre 100 pb y 40 kb. La eficiencia de recuperación disminuye significativamente para fragmentos de menor o mayor longitud que este rango.

4.La cantidad de ADN recuperado depende de la cantidad inicial de ADN, el volumen de elución y el tamaño del fragmento. Normalmente, para fragmentos de ADN de entre 100 pb y 5 kb, con un aporte de 1 a 15 μg, la tasa de recuperación puede alcanzar hasta el 85 %.

5.Al extirpar bandas de gel para la recuperación de ADN, la exposición a la luz ultravioleta puede dañar los fragmentos de ADN. Se recomienda utilizar luz ultravioleta de baja energía y longitud de onda larga en la medida de lo posible y minimizar la duración de la exposición.

6. El tampón de elución EB no contiene el agente quelante EDTA y no afecta la digestión enzimática, la ligación ni otras reacciones posteriores. También se puede usar agua para la elución, pero asegúrese de que su pH sea >7,5, ya que un pH demasiado bajo reducirá la eficiencia de la elución. El ADN eluido con agua debe almacenarse a –20 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, el ADN puede eluirse con tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0); sin embargo, el EDTA puede interferir con la digestión enzimática posterior. Si se utiliza, se recomienda una dilución adecuada.

7. Respecto al uso del tampón BL

1. Durante un almacenamiento prolongado, la membrana de sílice de las columnas de centrifugación para la unión de ácidos nucleicos puede reaccionar con cargas atmosféricas o polvo, lo que puede reducir su capacidad de unión. El pretratamiento de la columna con tampón BL reduce significativamente los grupos hidrófobos de la membrana de sílice y mejora su capacidad de unión, mejorando así el rendimiento o la eficiencia de la recuperación de ADN. La solución acondicionadora es una solución alcalina fuerte. En caso de contacto accidental, enjuague bien con abundante agua del grifo. Cierre siempre el frasco después de usar para evitar la exposición al aire. Almacenar a temperatura ambiente. Puede formarse precipitación durante el almacenamiento; si se forma, caliente a 37 °C hasta que se disuelva completamente antes de usar.
2. Procedimiento: Coloque una nueva columna de centrifugación con membrana de sílice en un tubo de recolección. Pipetee 100 μL de tampón BL en la columna. Centrifugue a 13 000 rpm durante 1 minuto. Deseche el líquido sobrante del tubo de recolección y vuelva a colocar la columna de centrifugación en el mismo tubo. La columna ya está lista para su uso. Continúe con los pasos siguientes.

VIII. Procedimiento (Por favor, lea las precauciones antes de comenzar el experimento):

Nota: Antes del primer uso, añada la cantidad especificada de etanol anhidro al tampón de lavado WB y mezcle bien. Tras la adición, marque inmediatamente la casilla para indicar que se ha añadido etanol y así evitar la repetición.

1. Bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga, utilice una cuchilla limpia para extirpar la banda de ADN objetivo. Retire la mayor cantidad posible de gel sin ADN para minimizar el volumen final del gel.

2.Transfiera la porción de gel extraída que contiene la banda de ADN a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y péselo.

Primero pese un tubo vacío de 1,5 mL y vuelva a pesarlo después de añadir la porción de gel. Reste los dos pesos para obtener el peso del gel.

3. Añade 3 volúmenes de tampón de lisis DD al gel.
Por ejemplo, si el gel pesa 100 mg (lo que puede considerarse aproximadamente 100 μL en volumen), agregue 300 μL de tampón de lisis.

Si la concentración de gel supera el 2%, agregue 6 volúmenes de tampón de lisis.

4. Incubar a 56 °C durante 10 minutos (o hasta que el gel se disuelva por completo). Agitar en vórtex cada 2-3 minutos para facilitar y acelerar la disolución.

5. Opcional (generalmente no obligatorio): agregue 150 μL de isopropanol por cada 100 mg de peso de gel inicial y agite para mezclar completamente.

En algunos casos, añadir isopropanol puede mejorar la eficiencia de recuperación. No centrifugar después de añadir isopropanol.

Para recuperar fragmentos mayores a 4 kb, no se debe agregar isopropanol, ya que puede reducir la eficiencia de recuperación.

Acondicionamiento de columnas con tampón BL:

El pretratamiento de la columna de centrifugación de membrana de sílice con tampón BL es un paso obligatorio. Para conocer el método específico, consulte la sección anterior "Uso de la solución de acondicionamiento de columnas".

6. Transfiera la solución obtenida en el paso anterior a la columna Spin EC (colocada en un tubo de recolección). Déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego centrifugue a 12 000 rpm durante 30-60 segundos. Deseche el líquido sobrante en el tubo de recolección.

Si el volumen total supera los 750 μL, la solución se puede cargar en la misma columna Spin EC en dos lotes separados.

El tampón de lisis filtrado puede mezclarse con la solución acondicionadora fuertemente alcalina residual que queda en el tubo de recolección, lo que provoca un cambio de color de amarillo a rojo anaranjado o incluso morado. Este cambio de color es normal en el indicador de pH rojo de fenol en condiciones alcalinas.

7.Agregue 600 μL de tampón de lavado WB, luego centrifugue a 12 000 rpm durante 30 segundos y deseche el flujo.

8.Transfiera la columna Spin EC a un tubo de centrífuga limpio. Aplique 50 μL de tampón de elución EB (precalentado en un baño de agua a 65-70 °C para obtener mejores resultados) directamente en el centro de la membrana de adsorción. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos y luego centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto. Para obtener una mayor cantidad de ADN, puede recargar el eluido en la misma columna y centrifugarlo durante un minuto más.

Un mayor volumen de elución generalmente resulta en una mayor eficiencia de elución. Si se requiere una mayor concentración de ADN, el volumen de elución puede reducirse según corresponda, pero el volumen mínimo no debe ser inferior a 25 μL. Volúmenes excesivamente pequeños reducirán la eficiencia de elución del ADN y el rendimiento final.