Kit de extracción de ARN total UltraPure con método de columna de centrifugación para investigación en ciencias biológicas

Introducción del producto

El kit de extracción rápida de ARN total UltraPure está diseñado para la extracción de ARN total de una amplia variedad de tejidos y células animales y vegetales. El tampón de lisis RL lisa eficazmente tejidos y células a la vez que inactiva las ARNasas. En combinación con las columnas de centrifugación específicas, extrae ARN total de alta pureza y calidad, libre de contaminantes como proteínas, ADN genómico y metabolitos celulares.

El ARN total extraído presenta buena integridad y está libre de contaminación por proteínas y ADN. Es adecuado para diversos experimentos rutinarios de biología molecular, como RT-PCR, PCR en tiempo real, Northern blot, Dot blot, selección de poli A, traducción in vitro, construcción de bibliotecas de ADNc, entre otros.

Especificaciones del producto

1. La membrana de sílice en todas las columnas de centrifugación está hecha de material de alta calidad, especialmente formulado, lo que garantiza una variación mínima en la capacidad de unión entre columnas.

2. Combina la estabilidad y alta pureza de los reactivos de un solo paso de tiocianato de guanidinio/fenol con la comodidad de las columnas de centrifugación. Elimina la necesidad de precipitación con isopropanol y lavado con etanol. El ARN se eluye directamente de la columna, evitando problemas de resuspensión difíciles por sobresecado.

3. La fórmula única de Lysis Buffer RL elimina eficazmente la contaminación del ADN genómico.

4. Múltiples pasos de lavado de columnas eliminan las proteínas contaminantes y los metabolitos celulares, lo que da como resultado ARN de alta pureza.

5. Reduce eficazmente el contenido de ARN 5S en el ARN total, mejorando la pureza.

Pasos de la operación

Preparación previa al experimento:

1.Siempre que sea posible, utilice tubos de microcentrífuga, puntas de pipeta y otros consumibles de plástico desechables estériles y sin ARNasa. Si utiliza material de vidrio o herramientas no desechables, trátelos previamente con DEPC o utilice un producto de descontaminación de ARNasa.

(1)Remojar las herramientas/recipientes en una solución acuosa de DEPC (pirocarbonato de dietilo) al 0,1%, protegida de la luz, durante 12 horas.

(2) Autoclave a 121 °C durante 30 minutos para eliminar el DEPC residual.

2. Use una bata de laboratorio, guantes de látex desechables y una mascarilla desechable durante la preparación de reactivos y los procedimientos experimentales para evitar la introducción de contaminación por ARNasa.

Pretratamiento de muestra:

1.Homogeneización de tejidos:

A.Tejido vegetal: Triture bien el tejido vegetal fresco en nitrógeno líquido o píquelo y muélalo directamente en el tampón de lisis RL. Añada 1 ml de tampón RL por cada 50-100 mg de tejido y mezcle. Nota: El volumen de la muestra no debe superar el 10 % del volumen del tampón RL.

B.Tejido animal: Picar el tejido animal fresco o congelado a -70 °C lo más fino posible. Añadir 1 ml de tampón de lisis RL por cada 30-100 mg de tejido y homogeneizar con un homogeneizador. Alternativamente, triturar en nitrógeno líquido, añadir 1 ml de tampón RL y mezclar. Nota: El volumen de la muestra no debe superar el 10 % del volumen del tampón RL.

DO.Células cultivadas en monocapa (células adherentes): Tras eliminar el medio de cultivo al máximo, añada directamente 1 ml de tampón de lisis RL para cubrir las células en una placa de cultivo de 3,5 cm y lise pipeteando repetidamente. La cantidad de tampón RL necesaria depende del área de cultivo, no del recuento celular (añada 1 ml por cada 10 cm²). Una cantidad insuficiente de tampón RL puede provocar contaminación del ADN en el ARN extraído.

Nota: Es posible que las células adheridas no se desprendan completamente del matraz/placa. Esto no indica una lisis incompleta, ya que es probable que las membranas celulares se hayan roto por completo y se haya liberado el ARN. Continúe con el protocolo.

D.Células en suspensión: Sedimente las células mediante centrifugación. Lise el sedimento en tampón de lisis RL pipeteando repetidamente. Añada 1 ml de tampón de lisis RL por cada 5 a 10 x 10⁶ células animales, vegetales o de levadura, o por cada 1 x 10⁷ células bacterianas. Evite lavar las células antes de añadir el tampón RL, ya que esto puede aumentar la degradación del ARNm. Puede ser necesario un homogeneizador para romper ciertas células de levaduras y bacterias.

MI.Para la extracción de ARN bacteriano, se recomienda el kit de extracción de ARN bacteriano (columna de centrifugación) (n.° de cat. YBR3220). Para la extracción de ARN en sangre, se recomienda el kit de extracción de ARN total TRI en sangre completa (muestra líquida) (n.° de cat. YBR3208).

Pasos de extracción:

1.Agite vigorosamente el homogeneizado e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.

2.Paso opcional: Centrifugar a 12 000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y transferir el sobrenadante. Este paso permite eliminar los residuos si la muestra contiene grandes cantidades de proteínas, grasas, polisacáridos o materiales como músculo o tubérculos. El pellet contiene paredes celulares, polisacáridos y ADN de alto peso molecular, mientras que el sobrenadante contiene ARN. En el caso de muestras de tejido graso, retirar la capa lipídica superior y utilizar el homogeneizado transparente para el siguiente paso.

3.Añada 0,2 mL de cloroformo por cada 1 mL de tampón de lisis RL utilizado. Tape bien el tubo, agite vigorosamente durante 15 segundos e incube a temperatura ambiente durante 3 minutos.

4.Centrifugar a 12 000 rpm durante 10-15 minutos a 4 °C en una centrífuga refrigerada de alta velocidad. Tras la centrifugación, la mezcla se separa en tres fases: una fase orgánica roja inferior, una interfase y una fase acuosa incolora superior. El ARN se encuentra en la fase acuosa superior, cuyo volumen es aproximadamente el 50-60 % del volumen original del tampón RL.

5.Transfiera con cuidado la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga nuevo sin ARNasa (evitando tocar la interfase). Registre el volumen de la fase acuosa. Añada 0,5 volúmenes de etanol anhidro (en relación con el volumen de la fase acuosa) y mezcle inmediatamente con la pipeta.

6.Transfiera la mezcla (en alícuotas de ≤700 µL si es necesario) a la columna SpinRA. Centrifugue a 12 000 rpm durante 45 segundos. Deseche el líquido sobrante y vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección.

7.Añadir 500 µL de tampón de desproteinización RE. Centrifugar a 12 000 rpm durante 45 segundos a temperatura ambiente. Desechar el líquido sobrante.

8.Añada 500 µL de tampón de lavado RW (asegúrese de añadir previamente el etanol). Centrifugue a 12 000 rpm durante 45 segundos. Deseche el líquido sobrante.

9.Repita el paso 9 una vez.4

10.Vuelva a colocar la columna SpinRA en el tubo de recolección vacío. Centrifugue a 13 000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente para secar completamente la membrana. Es fundamental eliminar el etanol residual, ya que puede inhibir las reacciones posteriores.

11.Transfiera la columna SpinRA a un nuevo tubo de microcentrífuga sin ARNasa (evite el contacto entre el fondo de la columna y cualquier fluido). Aplique 50-80 µL de H₂O sin ARNasa directamente al centro de la membrana. Deje reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos. Centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto para eluir el ARN. Conserve el ARN eluido a -80 °C para evitar su degradación.

Los volúmenes de elución mayores producen una mayor eficiencia de elución. Para una mayor concentración de ARN, se puede reducir el volumen de elución, pero se recomienda no usar menos de 30 µL, ya que volúmenes muy pequeños reducen la eficiencia de elución y el rendimiento.