Kit de purificación de fragmentos de ADN Método de columna de centrifugación Investigación en ciencias de la vida

Introducción del producto

En presencia de una sal caotrópica de alta concentración, los fragmentos de ADN se unen selectivamente a la membrana de sílice en la columna de centrifugación. Mediante una serie de lavados y centrifugaciones rápidas, el tampón de lavado elimina impurezas como cebadores, nucleótidos, proteínas y enzimas. Finalmente, se utiliza un tampón de elución con bajo contenido de sal y pH alto para eluir el ADN purificado de la membrana de sílice.

I. Información del producto:

II. Condiciones de almacenamiento:

1.Este kit se puede almacenar durante 12 meses en condiciones secas a temperatura ambiente (15 °C–25 °C).

2. Todas las soluciones deben ser transparentes. Si se produce precipitación debido a la baja temperatura, no deben utilizarse directamente. Calentarlas en un baño de agua a 37 °C durante varios minutos restaurará su transparencia. Antes de usarlas, deje que las soluciones recuperen la temperatura ambiente.

3.El almacenamiento a bajas temperaturas (4 °C o –20 °C) puede provocar precipitaciones y afectar el rendimiento; por lo tanto, el transporte y el almacenamiento deben realizarse a temperatura ambiente (15 °C–25 °C).

4.Para evitar la evaporación, oxidación o cambios de pH debido a la exposición prolongada al aire, cierre bien todos los recipientes de solución inmediatamente después de su uso.

III. Materiales que debe preparar el usuario:

Etanol absoluto, centrífuga de alta velocidad de sobremesa, baño de agua a temperatura constante, pipetas, tanque de electroforesis, sistema de imágenes en gel, etc.; marcador de ADN, colorante de carga, agarosa, tampón de electroforesis (1× TAE o 0,5× TBE), tubos de centrífuga de 1,5 mL, etc.

IV. Descripción del producto:

En presencia de una sal caotrópica de alta concentración, los fragmentos de ADN se unen selectivamente a la membrana de sílice en la columna de centrifugación. Mediante una serie de lavados y centrifugaciones rápidas, el tampón de lavado elimina impurezas como cebadores, nucleótidos, proteínas y enzimas. Finalmente, se utiliza un tampón de elución con bajo contenido de sal y pH alto para eluir el ADN purificado de la membrana de sílice.

V. Características del producto:

1.Todas las membranas de sílice en las columnas de centrifugación están hechas de material de adsorción de alta calidad y especialmente diseñado, lo que garantiza una variación mínima en la capacidad de unión entre columnas.

2. Utiliza un tampón de lisis de alta calidad que no contiene yoduro de sodio ni perclorato, que se encuentran comúnmente en las formulaciones tradicionales, evitando así la inhibición de reacciones enzimáticas posteriores, como la digestión, la ligadura y la clonación, después de la recuperación.

3. La fórmula única del Buffer DB integra funciones de lisis y unión, lo que permite utilizar un solo kit para diversas aplicaciones, como la recuperación de ADN de geles de agarosa, la limpieza y purificación de productos de PCR, y la purificación y recuperación de productos de digestión enzimática. Esto elimina la necesidad de adquirir varios kits especializados, lo que se traduce en un ahorro de costes.

4.El tampón DB está teñido de amarillo para facilitar el monitoreo visual del progreso de la lisis y los cambios de pH, logrando así condiciones de unión óptimas y mejorando significativamente la eficiencia de recuperación.

5.La formulación mejorada del tampón de lisis mejora enormemente la capacidad de amortiguación y la estabilidad, manteniendo el pH dentro del rango de unión óptimo incluso con tipos de muestras muy variables.

6. El procedimiento es rápido y cómodo, eliminando la necesidad de reactivos tóxicos como fenol y cloroformo, así como la precipitación con etanol.

VI. Solicitud:

Este producto es adecuado para la recuperación de ADN de geles de agarosa, purificación y recuperación de productos de reacción de PCR, purificación y recuperación de fragmentos de ADN digeridos enzimáticamente, purificación después del etiquetado de la sonda, concentración de muestras de ADN y otras aplicaciones relacionadas.

VII. Precauciones:

1. Este producto está destinado exclusivamente a fines de investigación. No está autorizado para su aplicación en medicina, diagnóstico clínico, alimentos, cosméticos ni fines afines.

2. Todos los pasos de centrifugación deben realizarse a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa convencional capaz de alcanzar 13.000 rpm.

3.El tampón de unión contiene compuestos irritantes. Se recomienda el uso de guantes de látex durante la operación para evitar el contacto con la piel, los ojos o la ropa. En caso de contacto con la piel o los ojos, enjuagar inmediatamente con abundante agua o suero fisiológico.

4. El rango típico de recuperación de fragmentos de ADN purificados se encuentra entre 100 pb y 40 kb. La eficiencia de recuperación disminuye significativamente para fragmentos más cortos o más largos que este rango.

5. La cantidad de ADN recuperado depende de la cantidad inicial de ADN, el volumen de elución y el tamaño del fragmento. En condiciones generales, para fragmentos de ADN de entre 1 y 15 μg y entre 100 pb y 5 kb, la tasa de recuperación puede alcanzar el 95 %.

6.El tampón de elución EB no contiene el agente quelante EDTA y no afecta la digestión enzimática, la ligación ni otras reacciones posteriores. También se puede usar agua para la elución, pero asegúrese de que su pH sea >7,5, ya que un pH demasiado bajo reducirá la eficiencia de la elución. El ADN eluido con agua debe almacenarse a –20 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, el ADN puede eluirse con tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0); sin embargo, el EDTA puede interferir con la digestión enzimática posterior. Si se utiliza, se recomienda una dilución adecuada.

7. Respecto al uso del tampón BL

1. Introducción: Durante el almacenamiento prolongado, la membrana de sílice de las columnas de centrifugación para la unión de ácidos nucleicos puede reaccionar con cargas atmosféricas o polvo, lo que puede reducir su capacidad de unión. El pretratamiento de la columna con tampón BL reduce significativamente los grupos hidrófobos de la membrana de sílice y mejora su capacidad de unión, mejorando así el rendimiento o la eficiencia de la recuperación de ADN. La solución acondicionadora es una solución alcalina fuerte. En caso de contacto accidental, enjuague bien con abundante agua del grifo. Cierre siempre el frasco después de usar para evitar la exposición al aire. Almacenar a temperatura ambiente. Puede formarse precipitación durante el almacenamiento; si se forma, caliente a 37 °C hasta que se disuelva completamente antes de usar.

2. Procedimiento: Coloque una nueva columna de centrifugación con membrana de sílice en un tubo de recolección. Pipetee 100 μL de tampón BL en la columna. Centrifugue a 13 000 rpm durante 1 minuto. Deseche el líquido sobrante del tubo de recolección y vuelva a colocar la columna de centrifugación en el mismo tubo. La columna ya está lista para su uso. Continúe con los pasos siguientes.

VIII. Procedimiento (Por favor, lea las precauciones antes de comenzar el experimento):

Nota: Antes del primer uso, añada la cantidad especificada de etanol anhidro al tampón de lavado WB y mezcle bien. Tras la adición, marque la casilla inmediatamente para indicar que se ha añadido etanol y evitar la repetición.

(1)Recuperación de ADN a partir de geles de agarosa

1.Bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga, utilice una cuchilla limpia para extirpar la banda de ADN objetivo. Retire la mayor cantidad posible de gel sin ADN para minimizar el volumen final del gel.

2.Transfiera la porción de gel extraída que contiene la banda de ADN a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y péselo.

Primero pese un tubo vacío de 1,5 mL y vuelva a pesarlo después de añadir la porción de gel. Reste los dos pesos para obtener el peso del gel.

3.Agregue 3 volúmenes de Buffer DB.

Si el gel pesa 100 mg, su volumen puede considerarse aproximadamente 100 μL; en consecuencia, agregue 300 μL de tampón de lisis.

Si la concentración de gel supera el 2%, agregue 6 volúmenes de tampón de lisis.

4. Incubar a 56 °C durante 10 minutos (o hasta que el gel se disuelva por completo). Agitar en vórtex cada 2-3 minutos para facilitar y acelerar la disolución.

5. Opcional (generalmente no obligatorio): agregue 150 μL de isopropanol por cada 100 mg de peso de gel inicial y agite para mezclar completamente.

En algunos casos, añadir isopropanol puede mejorar la eficiencia de recuperación. No centrifugar después de añadir isopropanol.

Para recuperar fragmentos mayores a 4 kb, no se debe agregar isopropanol, ya que puede reducir la eficiencia de recuperación.

Acondicionamiento de columnas con tampón BL:

El pretratamiento de la columna de centrifugación de membrana de sílice con tampón BL es un paso obligatorio. Para conocer el método específico, consulte la sección anterior "Uso de la solución de acondicionamiento de columnas".

6. Transfiera la solución obtenida en el paso anterior a la columna Spin EC (colocada en un tubo de recolección). Déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego centrifugue a 12 000 rpm durante 30-60 segundos. Deseche el líquido sobrante en el tubo de recolección.

Si el volumen total supera los 750 μL, la solución se puede cargar en la misma columna Spin EC en dos lotes separados.

Tras mezclarlo con la solución acondicionadora fuertemente alcalina residual que queda en el tubo de recolección, el tampón de lisis/unión filtrado puede cambiar de color de amarillo a rojo anaranjado o incluso morado. Este cambio de color es normal en el indicador de pH rojo de fenol en condiciones alcalinas.

7.Agregue 600 μL de tampón de lavado WB (¡verifique primero si se agregó etanol anhidro!), centrifugue a 12 000 rpm durante 30 segundos y deseche el flujo.

8. Agregue 600 μL de tampón de lavado WB, centrifugue a 12 000 rpm durante 30 segundos y deseche el flujo.

9. Coloque la columna Spin EC nuevamente en el tubo de recolección vacío y centrifugue a 12 000 rpm durante 2 minutos para eliminar completamente el tampón de lavado residual, ya que cualquier etanol restante en el tampón de lavado puede inhibir las reacciones posteriores.

10. Transfiera la columna Spin EC a un tubo de centrífuga limpio. Aplique 50 μL de tampón de elución EB (precalentado en baño maría a 65-70 °C para obtener mejores resultados) directamente en el centro de la membrana de adsorción. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos y luego centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto. Si se desea una mayor producción de ADN, el eluido puede recargarse en la misma columna y centrifugarse durante un minuto más.

Un mayor volumen de elución generalmente resulta en una mayor eficiencia de elución. Si se requiere una mayor concentración de ADN, el volumen de elución puede reducirse según corresponda; sin embargo, el volumen mínimo no debe ser inferior a 25 μL, ya que un volumen excesivamente pequeño reducirá la eficiencia de elución del ADN y el rendimiento general.

(2) Purificación de ADN para productos de PCR o fragmentos digeridos:

1. Por cada 100 μL de mezcla de amplificación post-PCR o post-digestión, añadir 500 μL de tampón de lisis/unión DB y mezclar bien. (Si el volumen inicial es inferior a 100 μL, ajustarlo previamente a 100 μL con agua bidestilada).

2.Transfiera la solución del paso anterior a una columna Spin EC (colocada en un tubo de recolección). Déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto, centrifugue a 12 000 rpm durante 30-60 segundos y deseche el líquido sobrante en el tubo de recolección.

3. A partir de este paso, el procedimiento es exactamente igual que los pasos 7 a 10 para la recuperación de ADN de geles de agarosa. Consulte los pasos 7 a 10 del protocolo "Recuperación de ADN de geles de agarosa".